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Un exemple concret
Après une PCR, on dépose les produits dans un gel d'agarose avec un marqueur de taille. Les fragments d'ADN migrent vers le pôle positif. Une bande située au même niveau que la bande de 500 paires de bases du marqueur indique un fragment d'environ 500 pb.
Le piège à éviter
Placer les puits du côté de la borne positive. L'ADN, chargé négativement à cause de ses groupements phosphate, migre vers l'anode, donc les dépôts doivent être placés du côté de la cathode, le pôle négatif.
Pour aller plus loin
Le gel est coulé avec des puits, placé dans une cuve remplie de tampon, puis relié à un générateur. On dépose dans les puits les échantillons mélangés à un tampon de charge, plus dense et coloré, qui fait descendre l'échantillon au fond du puits et permet de suivre l'avancée du front de migration. Après migration, l'ADN est révélé par un agent intercalant fluorescent sous UV ou par une coloration adaptée.
Pour l'ADN, la charge est proportionnelle à la longueur, si bien que toutes les molécules ont à peu près le même rapport charge sur masse : la séparation se fait essentiellement selon la taille. Le marqueur de taille, mélange de fragments de longueurs connues, sert de référence. On trace souvent le logarithme de la taille en fonction de la distance de migration, relation approximativement linéaire, pour estimer la taille d'un fragment inconnu. Le pourcentage d'agarose est choisi selon la taille des fragments à séparer.
Pour les protéines, on utilise souvent un gel de polyacrylamide en présence de SDS, un détergent qui dénature les protéines et leur donne une charge négative proportionnelle à leur masse. Elles sont alors séparées selon leur masse moléculaire. Les applications sont variées : vérification d'un produit de PCR, analyse d'une digestion par enzymes de restriction, recherche de mutations, identification génétique ou contrôle de la pureté d'une protéine. L'électrophorèse est une technique de référence en biotechnologies.
Ne pas confondre
- Chromatographie : La chromatographie sépare les espèces selon leur affinité pour une phase fixe et une phase mobile ; l'électrophorèse sépare selon la charge et la taille, sous l'effet d'un champ électrique.
- Électrolyse : L'électrolyse provoque une réaction chimique forcée aux électrodes ; l'électrophorèse déplace des molécules sans les transformer.
Dans ta copie
Les produits de PCR ont été déposés dans un gel d'agarose, à côté d'un marqueur de taille. Les puits étant placés du côté de la cathode, les fragments d'ADN, chargés négativement, ont migré vers l'anode. Le gel agit comme un tamis : les petits fragments migrent plus loin que les grands. Après révélation, l'échantillon présente une bande unique située au niveau de la bande de 700 pb du marqueur. Cette taille correspond à celle attendue pour le gène recherché, ce qui confirme que l'amplification est spécifique.
À retenir
- L'électrophorèse sépare des molécules chargées dans un champ électrique.
- L'ADN est chargé négativement et migre vers le pôle positif.
- Dans un gel, les petits fragments migrent plus loin que les grands.
- Un marqueur de taille permet d'estimer la longueur des fragments analysés.
Teste-toi
STL · question corrigée
Vers quel pôle migrent les fragments d'ADN lors d'une électrophorèse ?
Voir la réponse
Réponse B. Les groupements phosphate donnent à l'ADN une charge négative : il est attiré par l'anode, le pôle positif.
STL · question corrigée
Deux fragments de 300 pb et 1 200 pb migrent dans un même gel. Lequel ira le plus loin ?
Voir la réponse
Réponse D. Le gel freine davantage les grandes molécules : le fragment le plus court progresse le plus loin.
Questions fréquentes
À quoi sert le tampon de charge ?
Il alourdit l'échantillon pour qu'il tombe au fond du puits. Son colorant permet aussi de suivre la progression de la migration et de l'arrêter à temps.
Pourquoi l'ADN est-il invisible pendant la migration ?
L'ADN est incolore. Il faut le révéler avec un colorant ou un agent fluorescent, observé ensuite sous une lumière adaptée.
Notions liées
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